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10x ATAC新案例 | 整合單細胞轉錄組學和染色質可接近性分析揭示乳腺上皮細胞特性的新型調節
發布日期:2019-09-12瀏覽:

乳腺癌是一種異質性疾病,可分為6種不同的類型,分別為luminal A、luminal B、HER2-enriched、basal-like、normal breast和 claudin-low。乳腺癌起源于乳腺上皮,在人和小鼠中形成由2個主要細胞區室組成的導管上皮網絡,一層內腔細胞和一層基底/肌上皮細胞。

本研究通過從分離的乳腺上皮細胞(MECs)中利用單細胞轉錄組學(scRNA-seq)和染色質可接近性(scATAC-seq)分析來闡明介導小鼠乳腺上皮細胞特性的分子基礎。scRNA-seq/ ATAC-seq分析識別腔內乳腺上皮細胞室內先前未知的細胞狀態,并揭示與細胞特性和從腔內祖細胞分化為成熟相關細胞的新型順式和反式調節元件。
本文為正常體內平衡小鼠乳腺上皮系統內的細胞異質性提供了新見解,并將作為了解MEC系統在早期腫瘤發生和腫瘤進展過程中如何變化的寶貴資源。
 
研究思路
 
scATAC-seq實驗流程:
圖1
 
scRNA-seq流程:
圖2
 
一、主要內容
 
1.scATAC-seq揭示小鼠乳腺上皮中先前未知的細胞狀態
 
通過流式細胞術純化基底和管腔MEC后進行scATAC-seq(共23338個細胞),使用Cell Ranger軟件(10X Genomics)處理測數據后,再使用Seurat對所有peak進行無偏差聚類,顯示4個主要clusters(0-3)的MEC(圖3B);利用標記基因鑒定細胞類型為基底細胞(cluster 0;由Krt14標記),L-Sec(cluster 2-3;由Kit標記)和L HR(cluster1;由FoxA1標記)(圖3C)。
 
 
在L-Sec細胞類型中觀察到2個先前未知的cluster:Tm4sf1標記的調節PI3K途徑編碼參與乳腺癌轉移的四跨膜分子的cluter 2;和顯示編碼Wnt信號調節因子R-Spondin 1的基因Rspo1標記的cluster 3。另外,cluster 3也顯示基底標記基因Krt14的中度可接近性(圖3C),表明具有分化成基底和管腔譜系的雙能祖細胞狀態,或具有直接源自基底乳腺干細胞的短暫腔內祖細胞類型。
 
 
基于基因活性分析,在基底細胞中發現特異性開放的Wnt10a(圖3D),在基因啟動子區域周圍觀察到基底和管腔MEC之間的主要差異,Wnt10a的末端區域無差異;另外,管腔限制基因Cldn3在所有3個腔細胞簇中顯示出接近基因啟動子的高可接近性的一個主要peak(圖3E)。scATAC-seq分析定義了2個先前未知的細胞狀態,其特征在于分泌性腔上皮細胞類型(L-Sec)內的差異染色質可接近性特征(例如Rspo1)。
圖3   scATAC-seq分析
 
2、scRNA-seq分析揭示MEC細胞類型和狀態內不同的基因表達特征
對來自背景匹配的小鼠FACS分離的MEC進行scRNA-seq(共26859個細胞),使用Seurat聚類檢測到3個主要的上皮細胞簇,對應于基底(Krt14 +)、分泌腔(L-Sec; Kit / Elf5 +)和管腔激素反應細胞(L-HR; Prlr +);
 
在MEC的L-Sec cluster中檢測到2種不同的細胞狀態,在先前scRNA-seq研究中都作為一個同質簇出現。特異性標記基因表達顯示這些cluster中表達與產奶相關的幾個基因,而cluater 2表達與上皮祖細胞能力相關的高水平基因(Aldh1a3、Rspo1)。因此,將這些子簇命名為“L-sec Progenitor”和“L-sec Mature”(圖4B-C)。這些發現證實了scATAC-seq預測的L-sec細胞類型中存在兩種不同的狀態,并且允許將這些結果整合為腔內祖細胞和成熟分泌腔細胞。
圖4  scRNA-seq 分析
 
3.scRNA-seq和acATAC-seq整合揭示新型細胞類型特異性轉錄調節因子和順式調節元件
 
● 整合scRNA-seq和scATA-Cseq數據獲得關于染色質可接近性與乳腺上皮細胞類型中基因表達之間的聯系。
● 整合的數據集顯示每種主要細胞類型內的一致性,且概括了L-Sec細胞類型內的祖細胞和成熟細胞簇(圖5A);
● 乳腺細胞類型的幾個已知標志基因(如Krt5、Krt8、Kit、Foxa1)顯示染色質可接近性與每種細胞類型中的基因表達之間的強相關性(圖5B);
● 祖細胞中的Rspo1和成熟L-Sec細胞中的Lalba顯示染色質可接近性與基因表達的顯著一致性(圖5C)。
 
為了確定有助于細胞類型區分的順式調控元件,使用Cicero分析共同可接近性。比較L-Sec成熟細胞和L-Sec祖細胞,發現Folr1基因座附近的增強子特異性連接特異于L-Sec成熟群體(圖5D),基因表達和染色質可接近性揭示L-Sec成熟中Folr1的特異性信號(圖5E)。這表明染色體7上的這個增強子區域代表了在分化成成熟分泌腔內MEC期間變得活躍的關鍵調節元件。
 
利用ChromVar來分析scATAC-seq每種細胞類型的TF基序的可接近性,MEC系統中的TFmotif分析揭示3個主要模塊:
 
● 模塊1主要含與顯示應激反應相關的Jun和Fosrelated TF基序;
● 模塊2含許多與基底上皮生物學相關的TF(如Tp63),還觀察到與調節管腔細胞命運決定有關的Gata3 TF 基序;
● 模塊3主要含與腔上皮生物學相關的TF(Foxa1和Elf5)基序。
 
為了定義新建立的L-Sec成熟和祖細胞狀態之間的差異,比較這些cluster差異TF基序可接近性,其產生許多Wnt信號相關的TF,這與該簇中經典Wnt信號傳導Rspo1的增強子的表達增加一致(圖6)。
 
圖5    scATAC-seq與scRNA-seq整合分析
 
 
圖6   TF Motif分析
 
結論
 
⊙ 整合單細胞轉錄組學和染色質可接近性分析揭示了對MEC系統的腔內上皮區室內先前未知的細胞類型層次結構,并定義了調節乳腺上皮細胞特性的新型轉錄和表觀遺傳基礎;
⊙ 特別在分泌型腔細胞(L-Sec)中定義了不同的成熟狀態,其可以分為祖細胞(Rspo1、Aldh1a3)和成熟分泌細胞(Lalba、Csn2);
⊙ 通過整合轉錄組學和染色質可接近性數據集,將基序可接近性與陽性下游靶基因表達相結合推定的關鍵轉錄因子;
⊙ 還鑒定了新的增強子區域,其與基因可接近性和與分泌性腔成熟(Folr1)相關的效應基因的表達系統地相關,以及與基底、肌上皮細胞身份(Cnn2)相關。
 

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